【中药/天然分子设计】正构/变构天然分子与5-脂氧合酶作用机制的研究
5-脂氧合酶（5-lipoxygenase, 5-LOX）是生物体内含有非血红素离子的双加氧酶，是催化花生四烯酸（arachidonic acid, AA）生成白三烯类(leukotrienes, LTs)的关键酶。LTs是重要的炎症介质，参与许多疾病如动脉粥样硬化、心血管疾病、心脏病等病理生理过程。此外，研究发现5-LOX 在多种癌细胞，如前列腺癌、口腔癌、结肠癌、膀胱癌中过量表达。因此，5-LOX被认为是一种重要的治疗多种疾病的药物靶标，研究人员一直致力于5-LOX抑制剂的研究。近日，美国路易斯安娜州立大学研究人员探究了两个天然产物—活性位点的氧化还原抑制剂NDGA和变构抑制剂AKBA与5-LOX的不同作用机制。
首先，他们解析了分辨率为2.71Å 5-LOX和NDGA复合物的晶体结构，发现抑制剂NDGA诱导了5-LOX的催化区域的重塑，并将NDGA暴露在活性位点的深谷中，抑制剂NDGA仅通过与Arg596相互作用搭起了深谷间的桥梁。结构比较分析表明该复合物结构与稳定的apo 5-LOX封闭结构是完全不同的。进一步分析发现，NDGA的两个邻苯二酚环占据了一定的空间位置，导致锚定戊二烯的Phe177，Tyr181，Phe421和Asn425向外移动，从而引起了活性区域的无序性。随后，研究人员对5-LOX与不同底物结合时，5-LOX对蛋白质水解敏感性的问题进行了研究。研究发现5-LOX与AA相互作用时，5-LOX对蛋白质水解的敏感度并无变化，但当NDGA存在时，5-LOX对蛋白质水解的敏感度增加了5倍，证实抑制剂NDGA可以引起5-LOX活性位点区域内结构的无序性。
同时，研究人员解析了分辨率为3.0Å 5-LOX和AKBA复合物的晶体结构，发现AKBA位于氨基端和催化区域之间的深槽中，带有羧基和乙酸基的一端呈现扭曲的椅式结构，与Arg101，Thr137，Arg138和Val110形成极性相互作用。另一端由Leu66，Val110，Ile126和Lys133提供疏水作用。结构分析显示结合AKBA后，氨基端Trp102和催化区域Arg165间高度保守的阳离子-π相互作用以及Arg101和Asp166间的盐桥作用均消失，表明能够介导区域间的信号传递作用被破坏。结合B factors分析，进一步表明变构抑制剂AKBA的结合可以影响区域间的流动性及5-LOX构象的改变。
随后，研究人员分析了抑制剂NDGA和AKBA如何通过监测花生四烯酸AA的经典酶产物5-HETE和LTB4 的形成来调节5-LOX活性。实验结果表明，NDGA和AKBA对5-LOX的抑制呈浓度依赖性增强。此外，研究人员还监测到副产物12-HETE和15-HETE的产生。AKBA导致12-HETE的产生显著增加，其中10 μM时最为显著，但15-HETE并未受到影响。相反地，NDGA呈浓度依赖的方式抑制12-HETE和15-HETE的产生。
研究人员考虑到5-LOX在细胞环境中的复杂调控，为进一步评价抑制剂NDGA和AKBA在细胞环境下对5-LOX抑制活性的影响，研究人员通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法监测了HE293细胞中NDGA和AKBA对5-LOX的抑制效果。在HEK293细胞中，NDGA能够有效抑制5-LOX所有产物的生成。AKBA显著降低了5-LOX产物的产生，尤其是LTB4及其异构体。与此同时，研究人员发现在细胞环境下副产物12-HETE也会大量增加。此外，研究人员为证明AKBA的调节作用仅对5-LOX有效，他们同时在HEK239细胞中表达了12-LOX，15-LOX-1和15-LOX-2。实验结果表明AKBA对其他LOXs并没有抑制作用。这些数据显示AKBA诱导引起5-LOX区域专一性的改变，从而导致副产物12-HETE的产生，且仅对表达5-LOX的细胞有效，这表明AKBA对5-LOX的变构调控是具有异构体特异性的。
此外，研究人员通过在人中性粒细胞和巨噬细胞MDM中表达5-LOX的结果证实，AKBA诱导12-HETE的产生是发生在相关的病理生理条件下的。由于SPM的合成需要具有12/15-LOX活性，因此研究人员推测AKBA可以通过诱导5-LOX区域专一性向12/15-脂氧合酶转变，从而促进富含5-LOX的中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞中SPM的形成。综上所述，变构抑制剂AKBA不仅抑制5-LOX经典酶产物的形成，还能引起5-LOX区域专一性的改变。本研究为5-LOX的变构位点开发具有异构体特异性的变构抑制剂提供一种新策略。
参考文献
Gilbert, N.C., Gerstmeier, J., Schexnaydre, E.E. etal. Structural and mechanistic insights into 5-lipoxygenase inhibition bynatural products. Nat Chem Biol (2020).https://doi.org/10.1038/s41589-020-0544-7